Знаменский собор построен в конце XVII — начале XVIII веков. Западный корпус построен в 1809 году по проекту губернского архитектора И. Дмитрова на месте прежнего каменного, возведенного по велению новгородского митрополита Иова в начале XVIII века. К первой половине XVIII века относятся и северные корпуса.

В конце XVII века, когда Новгород испытывал большие экономические трудности, строительство Знаменского собора явилось важным событием в его религиозно-нравственной и художественной жизни. На этом месте в XIV веке стоял одноименный каменный храм, до основания разобранный в 1682 году. Название он получил от иконы Богоматери «Знамение», которая почиталась как местная святыня и до его строительства хранилась в церкви Спаса Преображения. По легенде, когда Новгород был осажден войсками суздальцев, город был не готов к обороне. Несколько дней архиепископ Илия молился о спасении города. Он пошел в Спасскую церковь, взял там икону «Знамения Божьей Матери» и поставил ее на крепостной стене лицом к нападавшим. Одна из стрел суздальцев попала в святую икону, и свершилось чудо. Икона сама отвернула свое лицо от нападавших и источила слезу. Тут же суздальцев постигла слепота, а защитники города разбили врага. На иконе и сейчас под левым глазом Богоматери виден след от той стрелы.

Первый каменный храм представлял собой небольшую четырехстолпную кубическую постройку с одной апсидой и одной главой. Сегодняшний собор возведен в 1682–1688 гг. Он сооружался на средства казны Софийского дома. Главным инициатором и организатором выступал новгородский митрополит Корнилий, известный широкой строительной деятельностью. Материальные затраты были значительными. В сооружении собора принимали участие как новгородские строители, так и мастера, приглашенные из других городов России. Известны имена двух кирпичников: Якушка Щербаков и Трофим Ульянов. Часть кирпича изготовлялась в Колмове. Вклад в сооружение Знаменского собора внесли и новгородские плотники, которые в 1687 году делали полы и тесовые кровли. Одну артель возглавлял Иван Полянский, другую – посадский человек Семен Алексеев. Стилистическое сходство собора и колокольни с ярославскими и костромскими постройками позволяют предполагать участие в каменных работах мастеров из Поволжья. Несмотря на перестройки и ремонты, собор хорошо сохранил архитектурные формы XVII века. Собор представляет собой тип монументального четырехстолпного трехапсидного храма, окруженного с трех сторон двухъярусными галереями и завершенного пятью куполами, из которых только центральный является световым. Здание разделено на два этажа. На галереи вели три симметричных крыльца – всхода, решенные в традиционной для XVII века манере: между столбами-кубышками перекинуты двойные арки с висячей гирькой. Сохранилось лишь западное крыльцо. Северное было перестроено, а южное со временем утрачено. Гладкие стены центрального объема разделены на три прясла лопатками, переходящими вверху в полуколонки. Фасады завершены тремя полукружиями ложных закомар. Существующее четырехскатное покрытие появилось во время одной из перестроек. Наличники окон в виде полуколонок с перехватами и килевидными подвышениями имеют трехцветную окраску: синюю, зеленую и красно-коричневую (она восстановлена в процессе реставрационных работ). Живописные композиции украшают тимпаны закомар. Часть декоративного первоначального убранства безвозвратно утрачена. Полностью осыпалась роспись на барабанах. Еще в начале XX века просматривались изображения херувимов, выполненные красной краской по тонкому известковому грунту, и растительный орнамент, нанесенный синей и желтой краской. Не уцелели прорезные позолоченные кресты на главах собора. Пострадали изразцовые фризы, опоясывающие галереи. В 1690-е годы, вскоре после строительства, пострадавший от пожара собор отремонтировали, возможно, изменили и форму покрытия. Тогда же приступили к оформлению интерьеров собора. В организации этих работ главная заслуга принадлежала митрополиту Иову. Яркая многокрасочная стенопись, появившаяся в 1702 году, еще более усилила величаво-торжественный праздничный характер интерьера.

В январе 1702 г. известный миниатюрист-золотописец посольского приказа Федор Юрьев и московский иконописец Иван Бахматов подрядились расписать собор. Сроки были предельно краткими: работу необходимо было завершить к 1 октября 1702 г. Для живописных работ подрядчики пригласили более 30 мастеров. В летописи, помещенной на южной стене храма, перечислены имена двадцати из них во главе с подрядчиком И. Бахматовым. Остается загадкой, почему в надписи нет имени Федора Юрьева, первыми среди мастеров названы три ведущих живописца из Костромы: Василий Осипов, Артемий Тимофеев и Филипп Андрианов. Все трое трудились в артели, которой руководил знаменитый художник XVII века Гурий Никитин. Главным знаменщиком выступал Василий Осипов Кондаков. Костромичи составили ядро артели. В нее вошли, помимо названных, Леонтий Марков, Артемий Филиппов, Михаил Артемьев и другие. С ними бок о бок работали известные ярославские мастера: Алексей Иванов и Федор Федоров, а также, предположительно, москвичи Иван Васильев, Артемий Иванов, Иван Алексеев.

Пострадал храм в сильный пожар 1745 г.: в паперти и на крыльцах потрескались от огня «окончины стеклянные», повредилась глава над северным приделом, опаянная жестью. Большие ремонтные работы были осуществлены на пожертвования графини Анны Орловой-Чесменской в 1844–1845 гг., а также в 1880 г. Значительные повреждения памятник получил в годы Великой Отечественной войны. В 1944 г. собор стоял без кровель, с зияющими дырами от снарядов, выломанными полами, закопченными фресками. Резные рамы иконостасов, по-видимому, были сожжены. Фашисты превратили храм в казарму.

Большую работу по спасению и реставрации Знаменского собора проделали работники Новгородской реставрационной мастерской. В 1950-е годы были проведены аварийно-ремонтные работы: сделана новая кровля и реставрированы отдельные архитектурные формы. Работы были продолжены в 1960–1970-е годы под руководством Г.М. Штендера. В них принимали участие архитекторы Г.П. Никольская и Н.Н. Кузьмина. Восстановление стенописей собора было начато в 1950-е годы московскими художниками и продолжено в 1970–1980-е годы бригадой новгородской реставрационной мастерской.