В 20-х годах XVI века архиепископом Макарием в новгородских монастырях был введен общежительный устав. В связи с этим во многих монастырях строятся трапезные.

Первоначально церковь Троицы имела, вероятно, придел Николая Чудотворца, который упоминается в описи 1591 года. В описях 1582 и 1686 гг. этот придел ошибочно назван самостоятельной церковью. Когда он упразднен – неизвестно. В трапезной на первом этаже сначала располагались поварня, хлебня и два квасных погреба, на втором этаже – трапезная и келарская. Памятник серьезно пострадал в годы шведской оккупации (1611–1617), а также от пожара 1685 года. Каменная трапезная с церковью Троицы Живоначальной в Духове монастыре построена в 1557 году, по заказу игумена Ионы.

В 1812 году на верхнем этаже трапезной был устроен придел Тихвинской иконы Божьей Матери. В 1821 году в северо-восточной части верхнего этажа трапезной устроена ризница. Архиепископ Макарий, описывая церковь Троицы в 1860 году, указывает, что к трапезной с западной стороны примыкает старинный каменный двухэтажный корпус (сестринский). В XIX веке (точная дата неизвестна) трапезная и церковь подверглись частичной перестройке: центральный столб и своды верхнего этажа трапезной разобраны, над трапезным залом устроено плоское покрытие, заложены или растесаны некоторые оконные проемы, первоначальное завершение церкви переделано на четырехскатное. Вероятно, работы велись в 20-х годах XIX века, так как известно, что в 1822 году Александр I пожертвовал 10 000 рублей на ремонт монастырских церквей. В 1910 году к югу от церкви Троицы построен новый одноэтажный каменный трапезный корпус с церковью Владимира, Михаила Тверского и мученицы Наталии.

Церковь Троицы Живоначальной относится к типу бесстолпных, пятиглавых, трехапсидных храмов с подцерковьем и подвалом. Подвал состоит из одного прямоугольного помещения, разделенного пополам поздней перегородкой с проемом. Помещение перекрыто коробовым с распалубками сводом. В толще западной стены расположены две каменные лестницы. Основной объем церкви решен нетрадиционно: подпружные арки с помощью парусов поддерживают центральный барабан с невысоким сферическим сводом. Фасады памятника отличаются изящным, умеренным использованным декором. Основной декоративный мотив – арки и ниши с килевидным завершением. Церковь сложена из известняковой плиты с двусторонней кирпичной облицовкой на известковом растворе. Покрытие церкви – тесовое, покрытие апсид и глав барабанов – городчатый лемех, покрытие трапезной – двускатное.

Церковь Троицы Живоначальной представляет собой высокохудожественный образец середины XVI века. Обладает рядом композиционных, конструктивных и декоративных особенностей. Отличается стройными, удачно найденными пропорциями.

Церковь была повреждена во время Второй мировой войны. Реставрирована в 1963 году по проекту архитектора Т.В. Гладенко.